Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Uwaga, nadeszła optogenetyka!

obrazek: fot.Andrzej Romański]
fot. Andrzej Romański

Wszystko wskazuje na to, że mózg jest jednym z najważniejszych organów każdego pracownika (i studenta) UMK. Jest to niezwykle złożony i dynamiczny obiekt biologiczny. Poznanie i zrozumienie działania mózgu należą do największych wyzwań nauki.

Dlatego w roku 2013 wystartował w ramach programu europejskiego Horizon 2020 Human Brain Project (HBP) z budżetem 1 mld euro (na okres 10 lat). Obecnie, na półmetku, pracuje nad nim 500 naukowców w 100 ośrodkach badawczych. W tym czasie ruszyły podobne wielkie projekty: chiński, japoński i amerykański. Jesteśmy żywotnie zainteresowani postępami neuronauk, wszak od sprawnego działania tego stosunkowo niewielkiego (1,225-1,375 kg, 0,8-2 litrów) fragmentu ludzkiego ciała tak wiele zależy.

Badania żywych mózgów nie są łatwe: 100 mld neuronów, 1015 synaps, cienka warstewka kory, trudny dostęp…. Podstawowe techniki to m.in. tomografia komputerowa (obciążająca obiekt badań), badanie EEG (słabe i trudne w interpretacji sygnały elektryczne zdejmowane ze skóry), tomografia magnetycznego rezonansu jądrowego, zwłaszcza w wersji funkcjonalnej (NMR jest kosztowny), magnetostymulacja przezczaszkowa, środki farmakologiczne, mikroelektrody (inwazyjne). Szczęśliwie od kilkunastu lat rozwija się nowa, bardzo obiecująca metoda poznawania procesów zachodzących w mózgu – optogenetyka. Od roku 2017 prowadzimy w tym zakresie badania w Zakładzie Biofizyki i Fizyki Medycznej Instytutu Fizyki UMK w Toruniu.

Dobrze wiemy, że siatkówka jest częścią układu nerwowego. Poza neuronami zawiera warstwę barwnikową czułą na światło. Fotony z zakresu widzialnego (380–750 nm) przechodzą przez przeźroczyste tkanki oka i są absorbowane przez specyficzne molekuły organiczne zawarte w komórkach wchodzących w skład siatkówki: w pręcikach i trzech rodzajach czopków. Takich światłoczułych komórek (jakby pikseli) mamy w siatkówce ok. 100 mln. Sądzę, że gdyby nie te komórki nie byłoby rewolucji kopernikańskiej. Co sprawia, że mózg rejestruje obraz? Jaki proces fizyczny prowadzi do zamiany kwantu promieniowania (fotonu) padającego na komórkę na wrażenia wzrokowe i dostarczanie informacji do mózgu? Początek tego szlaku sygnałowego jest dość dobrze poznany: fotony o określonej energii (albo inaczej fale elektromagnetyczne o właściwej długości) są absorbowane przez retinal (rys. 1) obecny w białku błonowym - rodopsynie. Pod wpływem dostarczonej energii następuje szybka i gwałtowna zmiana konformacji przestrzennej retinalu z formy „trans” do formy „cis”, co powoduje kaskadę zdarzeń molekularnych, prowadzących do wygenerowania impulsu nerwowego przez neurony siatkówki. Potencjały czynnościowe docierają do kory wzrokowe j i są odpowiednio interpretowane. Krytycznym, fizycznym elementem procesu jest zmiana przestrzenna zachodząca w fotoaktywnym białku pod wpływem światła. Bez tej fotoizomeryzacji nie ma pobudzenia odpowiednich neuronów.

Rodopsyna ludzka nie jest jedynym białkiem czułym na światło. Warto sobie uświadomić, że cała nasza cywilizacja opiera się na zdolności konwersji energii słonecznej do „form chemicznych” energii. Gdyby nie fotosynteza, zachodząca głównie w niezliczonych roślinach, nie mielibyśmy biosfery w obecnej formie, pokładów naszego cennego węgla, muzyki klasycznej i zapewne nie byłoby jakże ciekawych sporów politycznych na świecie. Znamy też wiele bakterii czułych na światło. Pod wpływem światła (lub jego braku) zmieniają one swoje zachowanie czy metabolizm.

Fizycy doskonale potrafią manipulować światłem. Wspaniale rozwinęła się optyka, triumfy odnosi optoelektronika. Świat bez światłowodowego Internetu byłby uboższy. Obecnie tylko w muzeach możemy obejrzeć telefony komórkowe nieposiadające zaawansowanego aparatu cyfrowego. Liczba wyprodukowanych cyfrowych aparatów fotograficznych sięga miliardów. Skoro potrafimy rejestrować nawet pojedyncze fotony, transformować je, odczytywać informacje niesione przez fale świetlne, a także formować ultraszybkie (femtosekundy) impulsy, to czy można zaprząc nasze zwykłe światło do badania mózgu i neuronów? Odpowiedź jest twierdząca, pomysł taki wydaje się oczywisty, ale konkretne rozwiązania pojawiły się dopiero na początku XXI wieku. Jednym z pomysłodawców nowej metody badania mózgu za pomocą światła (1979) był Francis Crick, ten sam, który wraz z J. Watsonem i M. Wilkinsem otrzymał nagrodę Nobla w 1962 za odkrycie struktury DNA.

Zwykłe neurony nie reagują na światło. Ale czy nie dałoby się wprowadzić do neuronów obcych białek fotoaktywnych i przy ich pomocy regulować ich działanie (aktywować lub hamować) światłem? Fotony z zakresu widzialnego czy podczerwieni są dość „delikatne”, łatwo można je dostarczać w określonym czasie, w określone miejsca mózgu, zatem „uczulenie” np. fragmentu kory mózgowej na światło pozwoliłoby lepiej badać funkcje i fizjologię układu nerwowego. Szczęśliwie metody inżynierii genetycznej i biologii molekularnej są obecnie tak rozwinięte, że oferują kilka sposobów wprowadzania obcych białek fotoaktywnych do neuronów.

Warto w tym miejscu przypomnieć jak odbywa się przewodzenie impulsu nerwowego. Wbrew naiwnym poglądom prąd elektryczny nie płynie wzdłuż długiego „kabelka”, za jaki niektórzy uważają neuron (rys. 2) . Impulsy nerwowe przenoszą się faktycznie wzdłuż neuronu, ale w postaci fali potencjału (napięcia). Złożone kompleksy białkowe, tzw. pompy sodowo-potasowe utrzymują w neuronach stałą różnicę potencjałów – wnętrze komórki ma potencjał spoczynkowy ujemny względem zewnętrza (ok. - 0.07 V). Różnice i zmiany potencjału pomiędzy wnętrzem a zewnętrzem komórki utrzymywane są faktycznie dzięki prądom, ale płynącym prostopadle do powierzchni neuronu. Prądy elektryczne polegają na przepływie jonów (K+, Na+, Cl_) przez wyspecjalizowane białka osadzone w błonie komórkowej neuronu zwane kanałami jonowymi. Lokalny spadek potencjału na fragmencie błony neuronu zmienia struktury kanałów jonowych w sąsiednim obszarze. W odpowiedniej sekwencji zamykają się i otwierają się kanały selektywnie transportujące jony sodu bądź potasu. Zmienia się wówczas stężenie jonów wewnątrz neuronu i stan tej chwilowej nierównowagi, objawiający się lokalnym skokiem potencjału w kierunku wartości dodatnich, propaguje się dalej i dalej. W ten sposób sygnał przenosi się wzdłuż aksonu komórki nerwowej niczym płomień w loncie prochowym.

Pompy sodowo-potasowe – kompleksy białkowe obecne w zielonej błonie aksonu – wytwarzają spoczynkowy potencjał neuronu. Wnętrze komórki nerwowej ma wówczas potencjał ujemny (--) w stosunku do otoczenia. Pobudzenie neuronu (sygnały dostarczone do drzewiastych dendrytów z lewej strony rysunku, gwiazdka) powoduje wzrost potencjału na początkowym fragmencie aksonu (a). Zauważają to zanurzone w błonie, sąsiednie do tej strefy, zależne od napięcia kanały jonowe, otwierają się na chwilę, przepuszczają w poprzek błony strumienie jonów sodu (oraz potasu), zatem potencjał elektryczny lokalnie rośnie. W kolejnych fragmentach błony aksonu (b) i (c) potencjał kolejno po chwili wzrasta, a w „starym” fragmencie zaczyna znów spadać. Kiedy kanały się zamkną (lewa strona różowego obszaru), po fazie repolaryzacji pojawia się ponownie zwykły potencjał spoczynkowy i akson jest gotowy w tym rejonie do przewodzenia kolejnego impulsu. Kierunek przewodzenia impulsu nerwowego pokazuje żółta strzałka.

Białka fotoaktywne z alg czy bakterii są zwykle kanałami jonowymi czułymi na światło. Posiadają w swojej strukturze fragmenty ulegające odwracalnej fotoizomeryzacji, np. wspomniany retinal. „Zamontowane” metodami genetycznymi w neuronach organizmów wyższych (nawet ssaków) aktywują neurony, zmieniając potencjał błonowy, ale tylko pod wpływem światła o określonej długości fali. Mogą też na żądanie, oczywiście pod wpływem światła, tłumić tymczasowo przewodzenie impulsów nerwowych. Widzimy, że pojawia się nowa droga zwalczania bólu - znieczulenie światłem.

Szczególnie ważne w optogenetyce białko opsyna ChR2 zostało wprowadzone przez K. Deisserotha i E.S. Boydena z Uniwersytetu Stanforda roku 2005. Opsyna ta, ,która jest aktywowana światłem niebieskim, pochodzi z alg z rodzaju Chlamydomonas reinhardtii. Geny tego (lub podobnych białek fotoaktywnych) wprowadza się do mózgu, m.in. za pomocą wektorów wirusowych podawanych w określone miejsce przez otworek czaszce. Na razie doświadczenia optogenetyczne wykonuje się na zwierzętach transgenicznych – mają one sztucznie zmodyfikowany genom, po to by w neuronach pojawiły się obce białka czułe na światło. Wielką zaletą optogenetyki jest duża rozdzielczość przestrzenna (rzędu mikronów) oraz bardzo dobra kontrola czasu aktywacji/deaktywacji wybranych fragmentów mózgu (rzędu milisekund). Otwiera to nowe możliwości badawcze i dlatego słusznie optogenetyka została nazwana „metodą roku 2010” przez redakcję czasopisma Nature Methods (więcej: https://www.youtube.com/watch?v=I64X7vHSHOE ).

Technikami optogenetycznymi można poznawać funkcje wybranych fragmentów mózgów zwierząt. Buduje się specjalne odbiorniki zaopatrzone w diody wysyłające na życzenie eksperymentatorów impulsy światła do głów szczurów swobodnie poruszających się. Wykonano przełomowe doświadczenia, w których poprzez stymulację światłem neuronów związanych z wydzielaniem dopaminy oduczono zwierzęta od uzależnienia od kokainy czy alkoholu. Techniki optogenetyczne pomogły uczulić na światło niewidome myszy. Panuje powszechne przekonanie, że liczne badania prowadzone z wykorzystaniem optogenetyki pomogą zrozumieć podłoże epilepsji, mechanizmy schizofrenii i działanie leków łagodzących skutki choroby Parkinsona. Fotonami można pobudzać lub hamować neurony ruchowe: laboratoryjne nicienie poruszają się w prawo lub w lewo sterowane pilotem na życzenie operatora.

Mechanizmy molekularne odpowiedzialne za otwieranie lub zamykanie kanałów jonowych przy pomocy światła nie są wciąż dobrze poznane. W naszej grupie realizujemy projekt wspierany przez grant NCN OPUS, który ma na celu wyjaśnienie, dlaczego niektóre białka mają tak fantastyczną zdolność reakcji na światło wykształconą w toku ewolucji. Metodami symulacji komputerowej białek, bez poświęcania zwierząt, staramy się poznać trybiki działania tych naturalnych zaworów (rys. 3). Nie jest to łatwe, bowiem symulacje muszą obejmować elektronowe stany wzbudzone dużych cząsteczek, a to wymaga rozwoju nowych metod obliczeniowych. Fotoizomeryzujące związki ciekawią nas z jeszcze innego względu: coraz modniejsza staje się fotofarmakologia. Badamy np. mechanizmy odpowiedzialne za wydzielanie insuliny z komórek trzustki. Zaburzenie tego wydzielania można łagodzić stosując pewne leki z grupy sulfonomoczników. Okazuje się, że bardzo obiecujące są próby kontrolowania wydzielania insuliny za pośrednictwem leków aktywowanych światłem, gdzie kluczową rolę odgrywa izomeryzacja cis-trans, podobnie jak w retinalu. Lek taki mógłby „ na żądanie”, tj. w momencie kiedy to potrzebne, zamykać kanał potasowy Kir6.2/Sur1 (rys. 4). Modele komputerowe tak pokaźnych kompleksów białkowych zanurzonych w błonie komórkowej nie były dotąd w Polsce badane. Dzięki lokalnym klastrom komputerowym (ICNT, WFAiIS) oraz dostępowi do krajowych centrów superkomputerowych, obliczenia te są obecnie możliwe.

Dlaczego staranna analiza procesów otwierania/zamykania tych kanałów jest tak ważna? Ponieważ to od tych drobnych szczegółów, np. zachowania poprawnej struktury na poziomie atomowym, zależy precyzyjna kontrola działania naszego mózgu oraz trzustki. Od takich „drobiazgów” zależy nasze zdrowie i zdolność do twórczego myślenia. Warto wiedzieć co jest mózgu „grane”. Rozumiejąc mechanikę tych białek możemy mieć nadzieję na opracowanie lepszych, bardziej efektywnych leków na wiele chorób psychicznych, metabolicznych czy wręcz niwelowanie wad wrodzonych, takich jak genetycznie uwarunkowana cukrzyca niemowląt.

Sterowanie układem nerwowym przy pomocy światła brzmi jak groźne science fiction. Niestety, w przypadku zwierząt to jest już rzeczywistość laboratoryjna. Czy technika ta przeniesie się kiedyś na ludzi? Czy skutki jej stosowania będą pozytywne czy złe? To będzie zależało od kręgosłupa moralnego i odpowiedzialności ekspertów zdolnych tą techniką się posługiwać. Nie przypadkiem jeden z 12 podprojektów HBP ma nazwę „Ethics and Society: Exploring the ethical and societal impact of HBP’s work”. Może, w odróżnieniu od innych mocno krytykowanych zadań flagowego projektu UE, ten wątek badań przyniesie konkretne efekty? Jak mówią w reklamach „stay tuned”.

pozostałe wiadomości