Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Zrozumieć proces zapalny – komputer w walce z chorobami

obrazek: Dr Karolina Mikulska-Rumińska fot.Andrzej Romański]
Dr Karolina Mikulska-Rumińska fot. Andrzej Romański

Ludzki organizm składa się z różnego rodzaju wyspecjalizowanych komórek. Każda z nich zbudowana jest m.in. z białek. Co ciekawe stanowią one aż ¾ całkowitej suchej masy naszego ciała. Białka nie tylko wpływają na kształt czy strukturę komórek, ale również są odpowiedzialne za pełnione przez nie funkcje.

A zatem nietrudno się domyślić, że defekty na poziomie molekularnym w elementach strukturalnych białek prowadzą do nieprawidłowości w normalnym funkcjonowaniu naszego organizmu, które określa się mianem chorób.

Białka na ekranie komputera?

Podstawowymi elementami strukturalnymi białek są aminokwasy, które składają się z atomów takich jak węgiel, wodór, azot czy też tlen. Pozycję poszczególnych atomów można określić m.in. dzięki krystalografii rentgenowskiej. To dzięki niej John Kendrew jako pierwszy, bo już w 1957 roku, uzyskał strukturę przestrzenną mioglobiny, białka odpowiedzialnego za magazynowanie tlenu w mięśniach. Krótko po nim Max Perutz otrzymał skrukturę hemoglobiny, białka transportującego tlen we krwi. To było zaledwie początkiem krystalografii biomolekuł, którą w czasie ostatnich dekad ciągle ulepszano. Obecnie znacznie efektywniej można uzyskiwać nowe struktury biologiczne, a w dodatku są one niejednokrotnie imponujących rozmiarów, tak jak struktura wirusa Polio pokazana na rysunku 1. Dodatkowo, oprócz wyżej wspomnianej krystalografii rentgenowskiej rozwinęły się również inne metody, takie jak magnetyczny rezonans jądrowy, czy też mikroskopia elektronowa, które także dostarczają informacji o strukturach przestrzennych biomolekuł. To wszystko sprawiło, że w pewnym momencie struktur przybyło tak dużo, że naukowcy postanowili utworzyć bazę, w której będą one przetrzymywane i dostępne dla każdego. Nazwano ją RCSB PDB (ang. Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank) i aktualnie liczy ona już ponad 170 000 struktur, a ich liczba wzrasta z każdym dniem.

Rys. 1.  Struktura przestrzenna wirusa Polio typu trzeciego uzyskana dzięki mikroskopii elektronowej, o kodzie PDB: 5O5B, licząca ponad 350 000 atomów, wyświetlona w programie do wizualizacji biomolekuł.

Można by zadać sobie pytanie: Co można zrobić z wiedzą na temat pozycji każdego z atomów w białku? Czy to w jakiś sposób może nam pomóc zrozumieć, jak działa białko i jaką pełni rolę w naszym organizmie? Takie pytania zadali sobie naukowcy już kilka dekad temu i zaskutkowało to powstaniem obliczeniowej biofizyki molekularnej. Jest to interdyscyplinarna dziedzina, która dzięki ogromnemu wzrostowi dostępnych mocy obliczeniowych oraz postępowi dokonanemu na polu samych metod obliczeniowych cały czas dynamicznie się rozwija. Jej głównym celem jest wyjaśnianie mechanizmów rządzących procesami biologicznymi w oparciu o prawa fizyki. Modele komputerowe, które tworzone są na postawie położenia atomów struktur białkowych umożliwiają symulowanie procesów zachodzących w prawdziwym świecie i są one kluczowe dla zrozumienia bądź też przewidywania eksperymentalnie uzyskiwanych wyników. Najlepszym tego przykładem są firmy farmaceutyczne, które do zaprojektowania efektywnego leku potrzebują przynajmniej 10 lat i setek milionów dolarów. By znacznie obniżyć te niebagatelne koszty i czas identyfikacji potencjalnych kandydatów na leki, wykorzystuje się właśnie metody obliczeniowe, bazujące na strukturach przestrzennych białek, które wywołują daną chorobę. Takie podejście daje ogromne możliwości, m.in. eliminowania leków, które nie działają w prawidłowy sposób, a byłyby eliminowane dopiero poprzez kosztowne i czasochłonne badania biochemiczne.

„Zobaczyć” jak działają białka

Białka to struktury dynamiczne, które w naturalnych warunkach zmieniają swoją strukturę i adoptują się do otaczającego ich środowiska. A zatem, by prawidłowo opisać zachowanie białka czy też kompleksów białkowych, oprócz ich struktury przestrzennej, potrzebna jest również wiedza na temat ruchu poszczególnych atomów. Prawidłowe opisanie pozycji i prędkości oddziałujących ze sobą atomów stało się celem dla wielu naukowców. Przez lata pracowano nad metodami, które we właściwy sposób opisywałyby ewolucję układu oddziałujących atomów. Metody te ustawicznie konfrontowano z eksperymentami, by możliwie najlepiej ulepszyć opis badanych struktur. Efektem tych działań jest m.in. dynamika molekularna. Metoda, w której położenie każdego atomu w układzie wyliczane są zgodnie z równaniem ruchu Newtona, a oddziaływania między poszczególnymi atomami określane są poprzez pole siłowe, które definiuje długości wiązań chemicznych, różnego rodzaju kąty, a także oddziaływania, m.in. elektrostatyczne oraz van der Waalsa. Dynamika molekularna stała się niezwykle użytecznym narzędziem w rękach naukowców, gdyż wnosi informację o każdym z atomów w układzie z wysoką rozdzielczością czasową (femtosekundową, 10-15 s). Symulacje te okazały się przydatne w rozszyfrowywaniu mechanizmów funkcjonalnych białek, kwasów nukleinowych, cukrów czy lipidów, odkrywaniu strukturalnych podstaw chorób, a także w projektowaniu i optymalizacji małych molekuł, peptydów i białek.

Nagroda Nobla za rozwijanie modelowania biomolekuł

Dla podkreślenia istotności metod obliczeniowych w 2013 roku uhonorowano prestiżową Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii trzech naukowców: Martina Karplusa, Michaela Levitta oraz Arieh Warshela za badania nad „wielkoskalowymi modelami złożonych systemów chemicznych”. Naukowcy ci od lat 70. minionego wieku systematycznie rozwijali podstawy pod używane dzisiaj modelowanie komputerowe systemów biologicznych i chemicznych. Gdyby nie oni, firmy farmaceutyczne nie tworzyłyby tak szybko skutecznych leków. Przemysł i niektóre technologie nie byłyby tak rozwinięte, a naukowcy i lekarze nie mieliby tak obszernej wiedzy na temat działania układów biologicznych, które przyczyniają się do powstawania chorób.

Co się dzieje z układem odpornościowym w chwilach zagrożenia?

W obecnych czasach szczególnie istotna stała się wiedza na temat zachowania naszego układu odpornościowego w momencie pojawienia się procesów zapalnych w organizmie. Zapaleniem określa się odpowiedź organizmu na szkodliwe bodźce zewnętrzne, takie jak patogeny, czynniki drażniące czy też uszkodzenia komórek, bądź tkanek. Zadaniem układu odpornościowego jest ochrona organizmu w chwilach zagrożenia, zatem wykorzystuje on wszelkie dostępne środki, by wyeliminować przyczynę uszkodzenia komórek, usunąć martwe tkanki oraz podjąć próbę naprawy. Organizmy żywe bronią się przed potencjalną infekcją na kilka sposobów. Najprostszą z nich są bariery fizyczne, w tym skóra, która stanowi powłokę ochronną dla całego organizmu przed szkodliwymi czynnikami zewnętrznymi, w tym również przed wirusami i bakteriami. Jeśli jednak patogenom uda się przełamać ten sposób zabezpieczenia, np. w wyniku skaleczenia, to błyskawicznie reaguje nasz układ odpornościowy. Dzieje się tak, ponieważ nasz organizm wyposażony jest w wyspecjalizowaną grupę wewnętrznych strażników, którzy chronią nas przed patogenami oraz czuwają nad prawidłowym funkcjonowaniem komórek naszego ciała. Leukocyty, bo to o nich mowa, są bardzo zróżnicowane i pełnią wiele wyspecjalizowanych funkcji np. fagocyty, do których zaliczają się neutrofile i makrofagi, wchłaniają i rozdrabniają patogeny.

Oprócz całego sztabu komórek w reakcji organizmu biorą również udział różnego rodzaju substacje i białka. Wśród białek szczególnie ważną funkcję pełnią cytokiny prozapalne, sprawiają bowiem, że stan zapalny jest inicjowany i trwa aż do momentu zlikwidowania zagrożenia. Ale zanim cytokiny prozapalne będą mogły pełnić swoją funkcję wymagane jest uformowanie innych struktur białkowych, które je najpierw aktywują. Jak dotąd jednym z lepiej zbadanych tego typu tworów jest inflamasom NLRP3. Ten wewnątrzkomórkowy kompleks białkowy jest nieaktywny w zdrowej komórce, a formę aktywną przybiera dopiero w chwili zagrożenia organizmu. Wtedy też nieaktywne białko NLRP3, od którego wzięła się nazwa inflamasomu, zmienia konformację i zaczyna grupować się oraz przyłączać białka adaptorowe ASC i nieaktywne kaspazy-1. To skutkuje aktywacją kaspazy-1, której główną funkcją jest konwersja nieaktywnych prozapalnych cytokin w ich formy aktywne. Są nimi interleukina-1β oraz interleukina-18, które są następnie wydzielane z komórek, biorąc udział w odpowiedzi prozaplalnej.

Przełomowe odkrycie nieznanego dotąd gracza układu odpornościowego

Wiedza na temat procesów zapalanych i odpowiedzi odpornościowej naszego organizmu jest coraz obszerniejsza, jednakże istnieje wciąż wiele niejasności, które amerykańscy badacze współpracujący z dr Karoliną Mikulska-Rumińską z Katedry Biofizyki UMK starają się wyjaśnić. Jedną z nich było poznanie roli i znaczenia interleukiny-1α. Białko to, podobnie jak wyżej wspomniana interleukina-1β, należy do rodziny interleukin-1. Obie formy białka są równie silnymi cytokinami prozapalnymi, przyłączają się do tego samego receptora, jednakże forma alfa jest znacznie mniej poznana. Co ciekawe, większość komórek wrodzonej odporności wykazuje ekspresję jednej z tych cytokin, ich receptora lub obu, dlatego prawie wszystkie komórki wrodzonego układu odpornościowego są w jakiś sposób zależne od działania interleukiny-1.

Niedawno opublikowane badania w prestiżowym czasopismie PNAS (2021) ujawniły, że komórki, w których brak jest interleukiny-1α, charakteryzują się zmniejszoną aktywnością inflamasomu NLRP3 oraz kaspazy-1. Prowadzi to w efekcie do zmniejszenia uwalniania interleukiny-1β oraz do zwiększenia uszkodzenia mitochondriów (tzw. mitofagii). Mitochondria to organelle komórkowe, które pełnią wiele ważnych funkcji w naszym organizmie m.in. stanowią centra energetyczne komórek, a także biorą udział w ich wzroście i śmierci. Rola interleukiny-1α jest więc niezwykle ważna, gdyż powoduje ona aktywację inflamasomu NLRP3, który jest niezbędnym elementem w inicjacji stanu zapalnego.

Kto z kim oddziałuje – podpowie komputer

Badacze zauważyli również, że pro-interleukina-1α (czyli nieaktywna forma interleukiny-1α) przy wywołaniu reakcji zapalnej (infekcji) przyłącza się do kardiolipiny zlokalizowanej w zewnętrznej błonie mitochondrium. Kardiolipina jest zwykle fosfolipidem błony mitochondrialnej wewnętrznej, ale przemieszcza się do zewnętrznej błony mitochondrialnej na skutek uszkodzeniu mitochondriów, dając sygnał „zjedz mnie”, by mogła nastąpić autofagocytoza. Autofagocytoza jest niczym innym jak kontrolowanym oczyszczeniem komórek z uszkodzonych i obumarłych części. Zakłócenie tego mechanizmu wywołuje różne choroby, wśród których wymienia się cukrzycę, chorobę Alzheimera czy nawet nowotwory. Do zbadania szczegółów tego oddziaływania na poziomie molekularnym posłużono się wcześniej wspomnianą metodą dynamiki molekularnej, w której uwzględniono pro-interleukinę-1α oraz błonę lipidową zawierającą kardiolipiny. Zaawansowane badania komputerowe wskazały aminokwasy, które są potencjalnym miejscem wiązania białka z kardiolipiną (Rys. 2), a ich mutacje w warunkach eksperymentalnych potwierdziły obserwacje komputerowe.

Rys. 2. Komputerowy model oddziaływania pro-interleukiny-1α (przedstawiona w formie beta nici (żółte) i alfa helisy (magenta) z błoną zewnętrzną mitochondrium składającą się m.in. z kardiolipiny (biała powierzchnia; dla oddziałującej z białkiem kardiolipiny zostały dodatkowo wyświetlone atomy kardiolipiny). Aminokwasy stanowiące peptyd sygnałowy (motyw sekwencyjny), kluczowy dla oddziaływań z błoną i kardiolipiną, zostały wyświetlone na strukturze przestrzennej białka oraz na sekwencji porównawczej z białkiem LC3b. Bladoróżowe sfery wskazują jony Ca2+, kluczowe dla oddziaływania białka z kardiolipiną.

Ponadto, po przeprowadzeniu analizy bioinformatycznej, okazało się również, że pro-interleukina-1α wiąże się z kardiolipinami za pomocą podobnego motywu sekwencyjnego co kluczowe białko autofagocytozy – LC3b (Rys. 2). Oznacza to, że w wyniku oddziaływania pro-interleukiny-1α z kardiolipiną zamiast białka LC3b następuje zahamowanie autofagocytozy mitochondriów (inaczej mitofagii). Innymi słowy nie ma sygnału „zjedz mnie”. Wtedy też następuje akumulacja uszkodzonych mitochondriów, które nasilają aktywność inflamasomu NLRP3 i powodują zwiększenie produkcji cytokin prozaplanych. Jest to bardzo ważne odkrycie, które może przyczynić się do opracowania nowych strategii leczenia stanów zapalnych w wielu różnych chorobach.

Badania opisane powyżej powstały dzięki współpracy międzynarodowej dr Karoliny Mikulskiej-Rumińskiej ze Szkołą Medyczną Uniwersytetu w Pittsburghu oraz z lekarzami z Centrum Medycznego Cedars-Sinai w Los Angeles.

Dr Karolina Mikulska-Rumińska – adiunkt w Katedrze Biofizyki - Wydział Fizyki Astronomii i Informatyki Stosowanej UMK, kierownik projektu „Mechanizmy molekularne, transdukcja sygnału i inhibicja kompleksu białkowego PEBP1-15LOX - inicjatora śmierci komórki na drodze ferroptozy” Narodowego Centrum Nauki.

pozostałe wiadomości